對蛋白質進行標記和偶聯操作可以賦予其新的功能，便于檢測、定位或者用于構建復雜的生物分子體系。其中，基于氨基反應的蛋白質標記和偶聯方法是一類非常重要的技術手段。

1、氨基在蛋(dan)白質(zhi)中的存在形式與(yu)特性

1）氨基酸結構中的氨基：蛋白(bai)質由氨基(ji)酸(suan)(suan)(suan)組成，許多(duo)氨基(ji)酸(suan)(suan)(suan)都含(han)有(you)氨基(ji)基(ji)團（-NH?）。在(zai)組成蛋白(bai)質的(de)20種(zhong)常見氨基(ji)酸(suan)(suan)(suan)中(zhong)，例(li)如賴氨酸(suan)(suan)(suan)（Lys），其側鏈上含(han)有(you)一個可反應的(de)氨基(ji)。這些氨基(ji)在(zai)蛋白(bai)質的(de)三維結構(gou)中(zhong)分布在(zai)不同的(de)位置(zhi)，有(you)的(de)暴露在(zai)蛋白(bai)質表面，容(rong)易(yi)(yi)與(yu)外(wai)界試(shi)劑發生反應，而有(you)的(de)可能由于蛋白(bai)質折疊而被(bei)包埋在(zai)內部，不易(yi)(yi)被(bei)觸及。

2）氨基的化學性質：氨(an)(an)基具有一定的(de)堿性(xing)，可以接受(shou)質子形成(cheng) -NH??。這種(zhong)堿性(xing)特性(xing)使(shi)得氨(an)(an)基在不同的(de)pH條件下具有不同的(de)反應(ying)活(huo)性(xing)。在偏中性(xing)到堿性(xing)的(de)環(huan)境中，氨(an)(an)基能夠與帶有活(huo)性(xing)官(guan)能團(tuan)的(de)化合物發生親核(he)取代反應(ying)或縮(suo)合反應(ying)等(deng)。氨(an)(an)基可以與羧基發生縮(suo)合反應(ying)形成(cheng)酰胺鍵(jian)，這一反應(ying)在蛋白質偶聯過程中經(jing)常被利(li)用。

2、常見的基于氨基反應的蛋白質標記和偶聯方法

1）戊二醛法：戊二醛是一種帶有兩個活性醛基的雙功能連接劑。它能夠借助兩端的醛基與蛋白質的氨基以共價鍵連接。反應機制涉及到醛基與氨基首先反應生成亞胺（西佛堿，schiff base）。反應條件相對溫和，可以在4-40°C，pH 6.8-9之間反應，反應時間通常控制在2-5小時。一般室溫下即可反應，如果反應物活性較高，也可以在4°C條件下反應。在磷酸緩沖液(ye)（pH6.8- 7.5）或者碳酸緩沖液（pH8-9）中都能進行反應，而且通常pH越高，西弗堿的生成率越高。這種方法的優點是操作簡單，連接效率較高。然而，也存在一些局限性，例如生成的西佛堿在反應條件下不是很穩定，可能會發生進一步的聚合反應，需要對反應條件進行精確的控制以確保偶聯的穩定性。

2）碳(tan)化二亞胺(an)法：碳化(hua)二亞(ya)(ya)胺類試劑（如EDC）是常用的(de)(de)偶聯(lian)試劑。它能(neng)夠活化(hua)含有(you)羧基(ji)的(de)(de)化(hua)合物(wu)，使(shi)其(qi)與(yu)蛋白質的(de)(de)氨基(ji)發生反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)形(xing)成(cheng)(cheng)酰胺鍵。在反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)過程中(zhong)，碳化(hua)二亞(ya)(ya)胺首先(xian)與(yu)羧基(ji)反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)形(xing)成(cheng)(cheng)一(yi)個活性(xing)中(zhong)間體(ti)(ti)，這個中(zhong)間體(ti)(ti)隨后與(yu)氨基(ji)反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)完成(cheng)(cheng)偶聯(lian)。反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)通常在水(shui)相體(ti)(ti)系(xi)中(zhong)進(jin)行(xing)，并且可以(yi)通過調(diao)節(jie)pH來(lai)優化(hua)反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)效率。一(yi)般來(lai)說，pH在4.5-6.0之(zhi)間比較適合。優點是可以(yi)在水(shui)溶液中(zhong)進(jin)行(xing)反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)，對許多生物(wu)分子(zi)的(de)(de)活性(xing)影(ying)響較小(xiao)。但(dan)是，反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)過程中(zhong)可能(neng)會(hui)產生一(yi)些副反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)，需要對反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)體(ti)(ti)系(xi)進(jin)行(xing)適當的(de)(de)優化(hua)以(yi)提高(gao)特異性(xing)。

3）重氮法：芳香族伯胺在低溫（0 - 5°C）和強酸（鹽酸或硫酸）溶液中與亞硝酸鈉作用，生成重氮鹽的反應稱為重氮化反應。若環上具有 -NO?或 -SO?H等的芳胺可以在較高一些（40-60°C）溫度進行重氮化反應。重氮鹽在弱酸、中性或堿溶液中與含有氨基的蛋白質作用，由偶(ou)氮基（N = N）將兩個分子偶聯起來，生成偶氮化合物的反應，稱為偶聯反應。這種方法的偶聯反應是親(qin)電取代反應，重氮陽離子是弱的親電試劑，它進攻蛋白質氨基所在位置苯環上電子出現幾率密度比較大的碳原子。反應需要嚴格控制反應條件，包括溫度、pH和反應物濃度等，以確保反應的特異性和效率。

3、蛋白質標記和偶聯過程中的關鍵因素

1）緩(huan)沖液(ye)(ye)體系：緩(huan)沖液(ye)(ye)的種類和pH值對(dui)氨基反(fan)(fan)應(ying)的偶(ou)聯(lian)過(guo)程至關(guan)重(zhong)要。不同的偶(ou)聯(lian)方法可能需(xu)要特定的pH范圍來確保(bao)反(fan)(fan)應(ying)的最佳效率。例如，碳化二(er)亞胺法在(zai)pH4.5-6.0之間較為(wei)合適，而戊二(er)醛法在(zai)pH6.8-9之間反(fan)(fan)應(ying)較好(hao)。合適的緩(huan)沖液(ye)(ye)還(huan)可以維持(chi)蛋白質的結構(gou)和活性，防止蛋白質在(zai)反(fan)(fan)應(ying)過(guo)程中變(bian)性。

2）反應溫度和時間：反應(ying)溫(wen)(wen)度和時(shi)間(jian)需要根據具體的(de)偶聯(lian)方(fang)法和反應(ying)物的(de)特性來確(que)定。一(yi)般來說，較低(di)的(de)溫(wen)(wen)度可(ke)以(yi)減少(shao)副(fu)反應(ying)的(de)發生(sheng)，但可(ke)能(neng)會(hui)降(jiang)低(di)反應(ying)速率。戊二醛法在室溫(wen)(wen)到40°C都可(ke)以(yi)反應(ying)，而重氮法需要嚴格(ge)控制溫(wen)(wen)度在0 - 5°C或者40 - 60°C（根據芳胺的(de)結(jie)構）。反應(ying)時(shi)間(jian)過長可(ke)能(neng)會(hui)導致不(bu)必要的(de)副(fu)反應(ying)或者蛋(dan)白(bai)質(zhi)變(bian)性，時(shi)間(jian)過短(duan)則可(ke)能(neng)導致偶聯(lian)不(bu)完全(quan)。

3）反應物濃度和比例：蛋白(bai)質與(yu)標記或偶聯(lian)(lian)試劑(ji)的濃(nong)度(du)和比例會影響(xiang)偶聯(lian)(lian)的效率和特(te)異性。如果(guo)標記試劑(ji)濃(nong)度(du)過高，可(ke)能會導(dao)致非(fei)特(te)異性結合或者過度(du)修飾，影響(xiang)蛋白(bai)質的活性。如果(guo)濃(nong)度(du)過低，則可(ke)能導(dao)致偶聯(lian)(lian)不完(wan)全。